分子生物學(xué)常用技術(shù)

　　核酸分子雜交技術(shù)


這種技術(shù)是利用高度特異性以及檢測(cè)方法的靈敏性，現(xiàn)在已經(jīng)成為zui基本的技術(shù)了，現(xiàn)在已經(jīng)被廣泛用于基因克隆了，酶切圖譜的制作，基因序列的定量和定性分析及基因突變的檢測(cè)等。其基本原理是具有一定同源性的原條核酸單鏈在一定的條件下（適宜的溫室度及離子強(qiáng)度等）可按堿基互補(bǔ)原成雙鏈。雜交的雙方是待測(cè)核酸序列及探針（probe）,待測(cè)核酸序列可以是克隆的基因征段，也可以是未克隆化的基因組DNA和細(xì)胞總RNA。核酸探針是指用放射性核素、生物素或其他活性物質(zhì)標(biāo)記的，能與特定的核酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)的已知DNA或RNA片段。根據(jù)其來(lái)源和性質(zhì)可分為cDNA探針、基因組探針、寡核苷酸探針、RNA探針等。


固相雜交


固相雜交（solid-phase hybridization）是將變性的DNA固定于固體基質(zhì)（硝酸纖維素膜或尼龍濾膜）上，再與探針進(jìn)行雜交，故也稱(chēng)為膜上印跡雜交。


斑步雜交（dot hybridization）


是道先將被測(cè)的DNA或RNA變性后固定在濾膜上然后加入過(guò)量的標(biāo)記好的DNA或RNA探針進(jìn)行雜交。該法的特點(diǎn)是操作簡(jiǎn)單，事先不用限制性?xún)?nèi)切酶消化或凝膠電永分離核酸樣品，可在同一張膜上同時(shí)進(jìn)行多個(gè)樣品的檢測(cè);根據(jù)斑點(diǎn)雜并的結(jié)果，可以推算出雜交陽(yáng)性的拷貝數(shù)。該法的缺點(diǎn)是不能鑒定所測(cè)基因的相對(duì)分子質(zhì)量，而且特異性較差，有一定比例的假陽(yáng)性。


印跡雜交（blotting hybridization）


Southern印跡雜交：凝膠電離經(jīng)限制性?xún)?nèi)切酶消化的DNA片段，將凝膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至硝基纖維素膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤固定，再與相對(duì)應(yīng)結(jié)構(gòu)的已標(biāo)記的探針進(jìn)行那時(shí)交反應(yīng)，用放射性自顯影或酶反應(yīng)顯色，檢測(cè)特定大小分子的含量。可進(jìn)行克隆基因的酶切圖譜分析、基因組基因的定性及定量分析、基因突變分析及限制性長(zhǎng)度多態(tài)性分析（RELP）等。


Northern印跡雜交:由Southerm印雜交法演變而來(lái)，其被測(cè)樣品是RNA。經(jīng)甲醛或聚乙二醛變性及電泳分離后，轉(zhuǎn)移到固相支持物上，進(jìn)行雜交反應(yīng)，以鑒定基中特定mRNA分子的量與大小。該法是研究基因表達(dá)常用的方法，可推臬出癌基因的表達(dá)程度。


差異雜交（differential hybridization）


是將基因組文庫(kù)的重組噬菌體DNA轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，用兩種混合的不同cDNA探針（如：轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性癌組織的mRNA逆轉(zhuǎn)錄后的cDNA）分別與濾膜上的DNA雜交，分析兩張濾膜上對(duì)應(yīng)位置雜交信息以分離差異表達(dá)的基因。適用于基因組不太復(fù)雜的真核生物（如酵母）表達(dá)基因的比較，假陽(yáng)性率較低。但對(duì)基因組非常復(fù)雜的鹽酸核生物（如人），則因工作量太大，表達(dá)的序列所占百分比較低（僅5%左右），價(jià)值不大。


cDNA微點(diǎn)隈雜交（cDNA microarray hybridization）


是指將cDNA克隆或cDNA的PCR產(chǎn)物以高度的列陣形式排布并結(jié)合于固相支持物上（如：尼龍膜或活化的載玻片）以微點(diǎn)陣，然后用混合的不同DNA探針與微點(diǎn)陣上的DNA進(jìn)行雜交。再利用熒光、化學(xué)發(fā)光、共聚焦顯微鏡等技術(shù)掃描微點(diǎn)陣上的雜交信息。它比差異雜交技術(shù)的效率高、速度快、成本低，適用于大規(guī)模的分析。已成商品問(wèn)世。其缺點(diǎn)是無(wú)法克服保守的同源序列及重序?qū)﹄s交信息的干擾。


寡核苷酸微點(diǎn)隈雜交（oligonucleotide microarray hybridization）


是在特殊的固相支持物上原位合成寡核苷酸，使它共價(jià)結(jié)合于支持物表面，與平均長(zhǎng)度為20-50nt的混合RNA或cDNA探針進(jìn)行雜交，以提高雜交的特異性和靈敏度。應(yīng)用共聚焦顯微鏡可檢測(cè)跨越三個(gè)數(shù)量級(jí)的雜交信息。適用于低豐度mRNA的檢測(cè)，以區(qū)分基因家族不同成員的差異表達(dá)特征，或鑒定同一轉(zhuǎn)錄在不同組織和細(xì)胞中的選擇性剪接。但有工作量較大、成本較高、速度較慢等弱點(diǎn)。


液相雜交（solution hbridization）


指使變性的待測(cè)核酸單鏈與放射笥核素標(biāo)記的已知的酸單鏈（探針）在溶液中保溫，使之形成雜交復(fù)合物。反應(yīng)結(jié)束后，用羥磷灰石法或酶解法將未被雜交的單鏈和雜交雙鏈分開(kāi)，然后結(jié)膈后在雜妝分子中的探針量，就可推算出被測(cè)的核酸量。


遞減雜交（subtractive hybridizatio）


是利用兩種來(lái)源一致而功能不同的組織細(xì)胞提取mRNA（或逆轉(zhuǎn)錄成的cDNA）,在一定的條件下以過(guò)量的驅(qū)動(dòng)mRNA或cDNA與測(cè)試的單鏈cDNA或mRNA進(jìn)行液相雜交，通過(guò)羥基磷灰石柱層析篩選除去兩者間同源的雜交體。經(jīng)多輪雜交策選、除去兩者之間相同的基因成分，保留特異表達(dá)的目的基因或工基因片段。以后者篩選cDNA文庫(kù)，可獲得特異表達(dá)的目的基因cDNA全長(zhǎng)序列。


核酸原位雜交


用特定標(biāo)記的已知順序核酸作為探針與細(xì)胞級(jí)或組織切片中核酸進(jìn)行復(fù)性雜交并對(duì)其實(shí)行檢測(cè)的方法，稱(chēng)為核酸原位雜交（nucleic acid hybridization in situ）。用來(lái)檢測(cè)DNA在細(xì)胞核或染色休上的分布，與細(xì)胞內(nèi)RNA進(jìn)行雜交以研究該組織細(xì)胞中特定基因表達(dá)水閏;還用于細(xì)胞、組織中有無(wú)特異性菌、病毒檢測(cè)的研究。


該法的優(yōu)點(diǎn)是特異性高，可定位;能在成分復(fù)雜的組織中進(jìn)行單一細(xì)胞的研究而不受同一組織中其他成分的影響;不需要從組織中提取核酸，對(duì)于組織中含量極低的靶序列有*的敏感性;并可完整地保持組織與細(xì)胞的形態(tài)。因此被廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)生物學(xué)的研究，如基因定位、基因制失，基因易位、特異基因整合部物色檢測(cè)等研究。近年來(lái)由定性發(fā)展到定量，方法更為完善。


DNA分子克隆技術(shù)（也稱(chēng)基因克隆技術(shù)）


在體外將DNA分子片段與載體DNA片段連接，轉(zhuǎn)入細(xì)胞獲得大量拷貝的過(guò)程中DNA分子克隆（或基因克隆）。其基本步驟包括：制備目的基因→將目的基因與載體用限制性?xún)?nèi)切酶切割和連接，制成DNA重組→導(dǎo)入宿主細(xì)胞→篩選、鑒定→擴(kuò)增和表達(dá)。載體（vecors）在細(xì)胞內(nèi)自我復(fù)制，并帶動(dòng)重組的分子片段共同增殖，從而產(chǎn)生大量的DNA分子片段。主要目的是獲得某一基因或NDA片段的大量拷貝，有了這些與親本分子*相同的分子克隆，就可以深入分析基因的結(jié)構(gòu)與功能，隨著引入的DNA片段不同，有兩種DNA庫(kù)，一種是基因組文庫(kù)（genomic library）,另一種是cDNA庫(kù)。


載體：所謂載體是指攜帶靶DNA片段進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的工具。

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